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国标木聚糖酶活力测定方法
发布时间:2015-11-30 来源:东恒华道 作者:渔 点击:

木聚糖酶活力测定方法摘自中华人民共和国轻工行业标准GB/T23874-2009

木聚糖酶活力测定的原理

木聚糖水解酶系是一类降解木聚糖的酶系,能将木聚糖降解成寡糖和单糖。还原性寡糖和单糖在沸水浴条件下可以与3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂反应显色反应。反应液颜色的深度与酶解产生的还原糖量成正比,而还原糖的生成量又与反应液中木聚糖酶的活力成正比。通过分光比色测定反应液颜色的强度,可以计算反应液中木聚糖酶的活力。

一、标准木糖曲线的制作

1、吸取PH5.5的0.1M乙酸-乙酸钠+缓冲溶液4.0mL,加入DNS试剂5.0mL,沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温,用水定容至25.0mL,制成标准空白样。

2、分别吸取木糖溶液1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL、6.00mL和7.00mL,分别用PH5.5的0.1M醋酸缓冲溶液定容至100mL,配制成浓度为0.10mg/mL、0.20mg/mL、0.30mg/mL、0.40mg/mL、0.50mg、0.60mg/mL和0.70mg/mL木糖标准溶液。

3、分别取上述浓度系列的木糖标准溶液各2.00mL(做两个平行),分别加入到刻度试管中,再分别加入2.0mL缓冲液和5.0mLDNS试剂。电磁振荡3s-5s,沸水浴加热5min。然后用自来水冷却到室温,在用水定溶液至25mL。以标准空白为对照调零,在540min处测定吸光度A值。

以木糖浓度为Y轴、吸光度A值为X轴,绘制标准曲线。每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线.


二、酶样测定

1、吸取10.0mL木聚糖溶液,37℃平衡20min。

2、吸取10.0经过适当稀释的酶液,37℃平衡10min。

3、吸取2.00mL经过适当稀释的酶液(已经过37℃平衡),加入到刻度试管中,再加入5mLDNS试剂,电磁振荡3s-5s。然后加入100mg/ml木聚糖溶液2.0ml,37℃保温30min,沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温,加水定容至25mL,电磁振荡3s-5s。以标准空白样(2.1.1)为空白对照,在540min处测定吸光度AB。

4、吸取2.00mL经过适当稀释的酶液(已经过37℃平衡),加入到刻度试管中,再加入100mg/ml木聚糖溶液2.0mL(已经过37℃平衡),电磁振荡3s-5s。37℃保温30min。加入5mLDNS试剂,电磁振荡3s-5s,以终止酶反应。沸水浴加热5min.用自来水冷却至室温,加水定容至25mL,电磁振荡3s-5s。以标准空白样(2.1.1)为空白对照,在540min处测定吸光度A。

木聚糖酶

三、计算

1、酶活定义:1g酶粉或1ml酶液在37℃、pH为5.50的条件下,每分钟从浓度为5mg/mL的木聚糖溶液中降解释放1umol还原糖所需的酶量为一个酶活力单位U。


2、用于酶解反应的稀释酶液中木聚糖酶的活力按式(1)和式(2)计算:

XD=【(AE- AE)*K+C0】/(M*t)*1000       ……………………… (1)

式中:

XD-稀释酶液中木聚糖酶的活力,U/ml;

AE-酶反应液的吸光度;

AB-酶空白样的吸光度;

K-标准曲线的斜率;

C0-标准曲线的截距;

M-木糖的摩尔质量,M(C5H10O5)=150.2g/mol

t-酶解反应时间,min

1000-转化因子,1mmol=1000umol.

XD值应在0.04U/mL-0.08U/ml之间。如果不在这个范围内,应重新选择酶液的稀释度,再进行分析测定。


X=XD*DF

式中:

X-试样中木聚糖酶的活力,U/g(或UmL);

DF-试样的稀释倍数;

酶活力的计算保留三位有效数字。


四、试剂

1、标准木聚糖溶液:木糖80℃烘干至恒重。标准称取1.000g木聚糖,加PH5.5的0.1M醋酸缓冲溶液溶解,定容至100ml。

2、1%木聚糖溶液:称取木聚糖1.00g加入PH5.5醋酸缓冲液,加热溶解后,定容至100ml。 

3、DNS显色剂

4、0.1M乙酸-乙酸钠缓冲溶液(PH5.5)

称取三水乙酸23.14,加入冰乙酸1.70mL。再加水溶解,定容至2000mL。

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